การศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมของกล้วยไม้สกุลม้าวิ่งในภาคตะวันออกเฉียงเหนือของไทยโดยการใช้เครื่องหมายดีเอ็นเอ

วัตถุประสงค์ของงานวิจัยนี้เพื่อประเมินความหลากหลายทางพันธุกรรมของกล้วยไม้สกุลม้าวิ่งต้นโดยใช้เครื่องหมายโมเลกุลดีเอ็นเอ เชื้อพันธุกรรมกล้วยไม้ที่นำมาศึกษาได้มาจากแหล่งกระจายพันธุ์ใน 5 จังหวัดในภาคตะวันออกเฉียงเหนือของประเทศไทยได้แก่ อุบลราชธานี ร้อยเอ็ด มุกดาหาร เลย และศรีสะเกษ รวม จำนวน 69 สายต้น จากการเปรียบเทียบวิธีการสกัดดีเอ็นเอ 4 วิธี พบว่า วิธีการสกัดดีเอ็นเอที่เหมาะสมในการสร้างลายพิมพ์ดีเอ็นเอของกล้วยไม้สกุลม้าวิ่ง คือ วิธี 2% CTAB with phenol-chloroform ของ Sue et al. (1997) โดยดีเอ็นเอที่สกัดได้มีปริมาณมากเฉลี่ย 5-10 ไมโครกรัม และคุณภาพดี โดยมีลักษณะใสไม่มีสี และวิธีนี้มีการปนเปื้อนของโพลีแซคคาไรด์ และสารประกอบฟีโนลิก น้อยเมื่อเปรียบเทียบกับวิธีอื่น
การประเมินความหลากหลายทางพันธุกรรมของกล้วยไม้สกุลม้าวิ่งจำนวน 50 สายต้น โดยเทคนิคอาร์เอพีดี เริ่มจากการศึกษาระดับความเข้มข้นขององค์ประกอบสารละลายในปฏิกิริยาอาร์เอพีดีที่เหมาะสม กำหนดตัวแปรขององค์ประกอบสารละลายที่จะศึกษา 3 ตัวแปรได้แก่ ความเข้มข้นของดีเอ็นเอ 2 ระดับ ได้แก่ 10 และ 20 นาโนกรัม ความเข้มข้นของแมกนีเซียมคลอไรด์ 3 ระดับ ได้แก่ 2, 2.5 และ 3.0 มิลลิโมลาร์ ความเข้มข้น Taq DNA polymerase 2 ระดับ ได้แก่ 0.5 และ 1 ยูนิต และกำหนดความเข้มข้นของ dNTPs และไพรเมอร์ OPA01 คงที่ คือ 200 และ 0.6 ไมโครโมลาร์ ตามลำดับ เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอโดยใช้ PCR profile ดังนี้ 94 องศาเซลเซียส นาน 5 นาที ตามด้วยโปรแกรมการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ 40 รอบ ที่ Denaturation 94 องศาเซลเซียส นาน 1 นาที Annealing 36 องศาเซลเซียส นาน 1 นาที และ Extension 72 องศาเซลเซียส นาน 2 นาที ตามด้วย Long Extension ที่ 72 องศาเซลเซียส นาน 10 นาที ผลการศึกษาพบว่า ระดับความเข้มข้นขององค์ประกอบสารละลายพีซีอาร์ของกล้วยไม้สกุลม้าวิ่งโดยเทคนิคอาร์เอพีดีที่เหมาะสมในปริมาตรรวม 20 ไมโครลิตร ได้แก่ ดีเอ็นต้นแบบ 10 นาโนกรัม Taq DNA polymerase 1 ยูนิต แมกนีเซียมคลอไรด์ (MgCl2) 2.5 มิลลิโมลาร์ dNTPs 200 ไมโครโมลาร์ ไพรเมอร์อาร์เอพีดี 0.6 ไมโครโมลาร์และสารละลาย PCR buffer 1X จากการคัดกรองไพรเมอร์อาร์เอพีดี จำนวน 110 ไพรเมอร์ พบว่า มี 27 ไพรเมอร์ให้แถบดีเอ็นเอที่ชัดเจน และแสดงความแตกต่างระหว่างสายต้น (polymorphism) เมื่อนำไพรเมอร์ดังกล่าวมาสร้างลายพิมพ์ดีเอ็นเอของกล้วยไม้สกุลม้าวิ่งจำนวน 50 สายต้น สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้แถบดีเอ็นเอที่แสดงความแตกต่างระหว่างพันธุ์ (เครื่องหมายอาร์เอพีดี) จำนวน 204 เครื่องหมาย แต่ละไพรเมอร์ให้เครื่องหมายอาร์เอพีดีได้ จำนวน ตั้งแต่ 2 ถึง 15 เครื่องหมาย คิดเป็นค่าเฉลี่ยเท่ากับ 7 เครื่องหมายต่อไพรเมอร์ นำข้อมูลเครื่องหมายอาร์เอพีดีมาวิเคราะห์ค่าสัมประสิทธิ์ความเหมือนทางพันธุกรรมโดยวิธีของ Dice (Dice’s Similarity coefficient) พบว่า มีค่าตั้งแต่ 0.43 ถึง 0.98 คิดเป็นค่าเฉลี่ยเท่ากับ 0.69 เมื่อนำมาจัดกลุ่มทางพันธุกรรมโดยวิธี UPGMA (UPGMA cluster analysis) และวิเคราะห์ปัจจัยหลัก (Principal component analysis: PCA) พบว่า จัดกลุ่มทางพันธุกรรมของกล้วยไม้สกุลม้าวิ่งได้เป็น 2 กลุ่มใหญ่และแยกกลุ่มกล้วยไม้ม้าวิ่ง และกล้วยไม้แดงอุบลได้อย่างชัดเจน ค่าผลรวมที่ได้จากการวิเคราะห์ปัจจัยหลัก สามปัจจัยแรกสามารถอธิบายความผันแปรทั้งหมดของการประเมินความเหมือนทางพันธุกรรมได้ 43.71 เปอร์เซ็นต์ และประเมินความเหมาะสมของการจัดกลุ่มทางพันธุกรรมจากค่า cophenetic correlation coefficient (r) พบว่า มีความน่าเชื่อถือในระดับปานกลาง (r=0.75)
การประเมินความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมของกล้วยไม้สกุลม้าวิ่งจำนวน 51 สายต้น ในภาคตะวันออกเฉียงเหนือโดยใช้เทคนิคเอเอฟแอลพี จากการคัดกรองไพรเมอร์เอเอฟแอลพี (EcoRI+3/MseI+3) จำนวน 40 คู่ พบว่า มี 12 คู่ไพรเมอร์ ให้แถบลายพิมพ์ดีเอ็นเอชัดเจน ได้แถบดีเอ็นเอที่แสดงความแตกต่างระหว่างพันธุ์ (AFLP markers) จำนวน 319 เครื่องหมาย คิดเป็นค่าเฉลี่ย 26.58 เครื่องหมายต่อคู่ไพรเมอร์ ค่า polymorphic information content (PIC) หรือ heterozygosity ของเครื่องหมายเอเอฟแอลพี มีค่าตั้งแต่ 0.01-0.50 โดยค่า PICs ในช่วง 0.46-0.50 คิดเป็น 70 เปอร์เซ็นต์ของจำนวนเครื่องหมายทั้งหมด นำข้อมูลเครื่องหมายเอเอฟแอลพีมาประเมินความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมโดยวิธีของ Dice พบว่า ค่าสัมประสิทธิ์ความเหมือนทางพันธุกรรมของเชื้อพันธุกรรมกล้วยไม้ม้าวิ่งที่ศึกษา มีค่าตั้งแต่ 0.46 ถึง 0.98 คิดเป็นค่าเฉลี่ยเท่ากับ 0.67 จากนั้นนำข้อมูลความเหมือนทางพันธุกรรมมาจัดกลุ่มโดยใช้วิธี UPGMA และการวิเคราะห์ปัจจัยหลัด (PCA) สามารถจัดกลุ่มกล้วยไม้สกุลม้าวิ่งได้เป็น 4 กลุ่ม และแยกกลุ่มกล้วยไม้ม้าวิ่ง และกล้วยไม้แดงอุบลได้อย่างชัดเจน ผลการวิเคราะห์ปัจจัยหลัก (PCA) สามพารามิเตอร์แรก สามารถอธิบายความผันแปรของการประเมินควาเหมือนทางพันธุกรรมได้ 52.82 เปอร์เซ็นต์ การจัดกลุ่มทางพันธุกรรมมีความน่าเชื่อถือในระดับสูง (r=0.86)
การเปรียบเทียบประสิทธิภาพระหว่างเทคนิคอาร์เอพีดี และเอเอฟแอลพีในการประเมินความผันแปรทางพันธุกรรมของกล้วยไม้สกุลม้าวิ่ง จำยนวน 32 สายต้น พบว่า การสร้างลายพิมพ์ดีเอ็นเอของเชื้อพันธุกรรมกล้วยไม้สกุลม้าวิ่ง จากเทคนิคอาร์เอพีดี จำนวน 22 assays และเทคนิคเอเอฟแอลพี จำนวน 12 assays สามารถได้ polymorphic markers จำนวน 165 และ 299 เครื่องหมาย ตามลำดับ คิดเป็นค่าเฉลี่ย 7.5 และ 26.58 เครื่องหมาย assay ตามลำดับ โดยพบว่า เทคนิคเอเอฟแอลพีสามารถให้ค่า effextive multiplex ratio ซึ่งหมายถึง จำนวนของ polymorphic marker ที่ได้ในหนึ่งปฏิกิริยา สูงกว่า เทคนิคอาร์เอพีดี ถึง 3.5 เท่า และเมื่อพิจารณาค่า marker index ซึ่งเป็นผลคูณระหว่างค่า effective multiplex ratio และค่า heterozygosity พบว่า เทคนิคเอเอฟแอลพีมีค่า marker index สูงกว่าเทคนิคอาร์เอพีดี (7.44 และ 2.55 ตามลำดับ) ถึง 2.9 เท่า เมื่อนำเครื่องหมายอาร์เอพีดี และเครื่องหมายเอเอฟแอลพี รวมจำนวน 464 เครื่องหมาย มาวิเคราะห์ค่าสัมประสิทธิ์ความเหมือนกันทางพันธุกรรมด้วยวิธีของ Dice พบว่า มีค่าตั้งแต่ 0.50 ถึง 0.96 โดยมีค่าเฉลี่ยเท่ากับ 0.67 จากนั้นนำมาจัดกลุ่มพันธุกรรมมีความเหมาะสมและน่าเชื่อถือในระดับสูง (r=0.87)
ผลการศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมของกล้วยไม้สกุลม้าวิ่งจากแหล่งกระจายพันธุ์ใน 5 จังหวัดในภาคตะวันออกเฉียงเหนือของประเทศไทยโดยใช้เครื่องหมายโมเลกุลดีเอ็นเอ (อาร์เอพีดี และ เอเอฟแอลพี) พบว่า เชื้อพันธุกรรมกล้วยไม้สกุลม้าวิ่งดังกล่าว มีความหลากหลายทางพันธุกรรมค่อนข้างต่ำ จากผลการศึกษาแสดงให้เห็นว่าเทคนิคเอเอฟแอลพีมีความเหมาะสมในการนำมาสร้างลายพิมพ์ดีเอ็นเอเพื่อศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิตได้อย่างมีประสิทธิภาพ ข้อมูลความหลากหลายทางพันธุกรรมของเชื้อพันธุกรรมกล้วยไม้สกุลม้าวิ่ง จะเป็นฐานข้อมูลสำคัญทางพันธุกรรมในการปรับปรุงพันธุ์กล้วยไม้สกุลม้าวิ่งเพื่อการค้าต่อไปในอนาคต